US-Patent für GFP Super Resolution Lokalisations-Mikroskopie erteilt
Sichtbares Laserlicht gibt große Zellbereiche in zwei Dimensionen und Zellkomplexe mit einer Auflösung von wenigen Nanometern in 2D oder einigen zehn Nanometern in 3D zu erkennen.
Grundlegend für die SPDMphymod-Technologie (Spectral Precision Distance Microscopy with physically modifiable fluorophores) ist das Phänomen der blinkenden Moleküle. Die fluoreszierenden Moleküle geben Licht gleicher spektraler Frequenz ab, jedoch mit verschiedener spektraler Signatur, bedingt durch ihre charakteristischen Blink-Eigenschaften. Herkömmliche, gut etablierte und kostengünstige Fluoreszenzfarbstoffe wie natürlich vorkommendes GFP, dessen Derivate RFP, YFP sowie Alexa, Atto, Cy2 und Cy3 Farbstoffe, können somit ohne weitere Modifikation verwendet werden. Ein weiterer praktischer Vorteil für den Laboralltag ergibt sich durch die Verwendung von Standard-Einbettungsmitteln für Präparate oder durch das Arbeiten unter den physiologischen Bedingungen der lebenden Zelle. Zwei oder drei herkömmliche Farbstoffe können so nanoskopisch im Co-Lokalisations-Modus erfasst werden, entweder als Fluoreszenz-Fusionsproteine, als fluoreszenz-markierte Antikörper oder als Kombinationen davon.
Abb.: GFP / RFP Zweifarben-Lokalisationsmikroskopie SPDMphymod / Super Resolution Mikroskopie im Zellkern einer Knochenzelle. Genaue Zählung der Einzelmoleküle: 70.000 RFP-H2A Histonmoleküle und 50.000 GPF-Snf2H Chromatin Remodeling Proteine (Blickfeld von 470 Quadratmikrometern, optische Tiefe von 600 Nanometern, jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Molekül, Gesamtzahl 120.000). (Bild: C. Cremer)
Millionen weltweit bereits vorhandener biologischer Proben, können nun endlich auch auf Einzelmolekülebene untersucht werden. Dies erfolgt ohne zusätzlichen technischen Aufwand, denn die Proben werden genauso wie bei einer Untersuchung mit einem gewöhnlichen konfokalen Fluoreszenz- oder Epifluoreszenzmikroskop behandelt.
Am 19. März 2008 reichte Christoph Cremer, Professor an der Universität Heidelberg und Gruppenleiter am Institut für Molekulare Biologie gGmbH (IMB) in Mainz, die SPDMphymod-Technologie zur Patentanmeldung ein. Die Veröffentlichungen der wissenschaftlichen Ergebnisse folgten im Mai 2008 und im September 2008.
Seitdem hat das Cremer-Labor stetig neue biologische Anwendungen zur SPDMphymod-Technologie durchgeführt und publiziert und konnte somit die Relevanz dieser Schlüsseltechnologie für die molekularbiologische Forschung unter Beweis stellen: von nanoskopischen Untersuchungen des Zellkerns bis hin molekularen Studien von Zellkernmembranen, zytoplasmatischen Strukturen, klinisch wichtigen Zellmembranrezeptoren und der Analyse von Zellverbindungssystemen.
Durch die Verwendung sichtbaren Laserlichts können nicht nur große Zellbereiche zweidimensional untersucht werden, sondern auch Zellkomplexe mit einer räumlichen Auflösung bis in den Bereich von wenigen Nanometern in 2D oder einigen zehn Nanometern im 3D-Modus. Die 2D-Auflösung erfolgt bis zu einer Dichte von 2,8 × 10.000 pro Quadratmikrometer innerhalb einer Fläche von bis zu 5000 Quadratmikrometer.
Hat der Einsatz des natürlich vorkommenden GFP (grün fluoreszierendes Protein aus Quallen) und seiner Derivate bereits die Möglichkeiten der zellbiologischen Untersuchungen revolutioniert, so beginnt in Kombination mit der Super Resolution Mikroskopie eine neue Ära der biomolekularen Forschung. Martin Chalfie, Osamu Shimomura, und Roger Y. Tsien wurden 2008 mit dem Nobelpreis für Chemie für ihre Entdeckung, Entwicklung und Einsatz in der Molekularbiologie des grün fluoreszierenden Proteins ausgezeichnet.
Das US-Patent für SPDMphymod basiert auf der SPDM-Patent-Familie, der ersten Weitfeld basierten Lokalisierungs-Mikroskopie-Technik. Sie wurde seit Mitte der 1990er Jahre entwickelt und erreicht eine effektive optische Auflösung, die um ein ein Vielfaches besser ist als die konventionelle optische Auflösung. Christoph Cremer hat bereits 1971 die theoretischen Berechnungen für den Bau des 4Pi Super Resolution Mikroskops zum Patent angemeldet.
Die SPDMphymod-Technologie beruht auf einem einfachen technischen Aufbau und bietet den zusätzlichen Vorteil, dass eine einzige Laserwellenlänge geeigneter Intensität für das Nanoimaging von Molekülen ausreicht – im Unterschied zu anderen Lokalisationsmikroskopie-Technologien, welche typischerweise zwei Laserwellenlängen in Verbindung mit speziellen photo-schaltbaren oder photo-aktivierbaren Molekülen und / oder eine bestimmte chemische Umgebung benötigen.
Es ist entscheidend für SPDMphymod, dass durch die Lichtanregung ein einzelnes Molekül zunächst in einen sehr langlebigen reversiblen dunklen Zustand fällt (mit einer Halbwertszeit von mehreren Sekunden bis Minuten, also um Größenordnungen länger als die typischen Grundzustand-Triplett-Übergänge), von dem es in einen fluoreszierenden Zustand zurückkehrt. Dabei emittiert es viele Tausende von Photonen innerhalb mehrerer Zehntel Millisekunden, bevor es in einen sehr langlebigen irreversiblen dunklen Zustand zurückfällt.
Das Patent-Portfolio für die 2D und 3D Super Resolution Mikroskopie in Form der Lokalisationsmikroskopie und der strukturierten Beleuchtung wird in Kombination mit molekularbiologischen Anwendungen in der Zukunft eine wichtige Rolle in der pharmazeutischen, zellbiologischen, medizinischen und biophysikalischen Forschung spielen, das heißt, überall dort, wo molekulares Nanoimaging auf zellulärer Ebene erforderlich ist. So können verborgene Proteine oder Nukleinsäuren eines pharmakologisch aktiven 3D-Molekül-Komplex sichtbar gemacht werden, ohne den Komplex selbst zu zerstören.
TLB / PH
