Doping für die STED-Mikroskopie

Einst galt das Abbesche Beugungsgesetz als eherner Grenz­pfahl für das Auf­lösungs­ver­mögen optischer Mikro­skope. Die Über­windung dieser Grenze durch moderne Methoden der Fluores­zenz­mikro­skopie war deshalb eine große Über­raschung – vor allem für alle Zell­bio­logen, denen sich nun ganz neue Unter­suchungs­möglich­keiten eröff­neten. Weniger über­raschend war deshalb die Verlei­hung des Nobel­preises in Chemie 2014 an Stefan Hell, Eric Betzig und William Moerner für die Entwick­lung dieser neuen Methode. Der Trick bei der „Stimu­lated Emission Deple­tion“, kurz STED: Die Probe wird mit fluores­zie­renden Farb­stoffen markiert und Schritt für Schritt mit einem Objekt­strahl abge­rastert. Gleich­zeitig sorgt ein inten­siver, Donut-förmiger Abregungs­strahl dafür, dass nur exakt in der Mitte dieses Strahls Fluores­zenz möglich ist. Dadurch lässt sich der Bereich, aus dem Fluores­zenz­strahlung abge­geben wird, deutlich schärfer ein­grenzen als nach dem Abbe-Limit möglich.

Vor allem die Möglichkeit, Fluoreszenzmarker etwa über spezielle Anti­körper an die gewünschten Stellen in einer Zelle zu binden, macht die STED-Mikro­skopie inte­res­sant. Dadurch eröff­net sich die Möglich­keit, Lebens­prozesse in bislang für unmög­lich gehal­tener Detail­schärfe abzu­bilden. Ein Problem dabei ist jedoch die hohe not­wendige Inten­sität des Abre­gungs­strahls. Je höher die gewünschte Auf­lösung, desto stärker muss dieser auf die Probe strahlen, so dass schließ­lich nur noch eine mög­lichst schmale Öff­nung in der Mitte Fluores­zenz­licht abgibt. Bei einer gewünschten Auf­lösung von etwa dreißig Nano­metern können dabei durch­aus Laser­inten­si­täten von einigen hundert Milli­watt not­wendig werden. Bei solch hohen Inten­si­täten kann nicht nur der Fluores­zenz­farb­stoff aus­bleichen – es droht auch photo­ther­mischer Schaden für empfind­liche biolo­gische Struk­turen.

Ein Team um Dayong Jin von der Uni Sydney hat deshalb versucht, mit neu­artigen Nano­partikeln niedri­gere Abre­gungs­intensi­täten zu ermög­lichen. Hierbei erwies sich insbe­sondere Thulium als viel ver­sprechende Substanz. Thulium ist ein Lantha­noid mit der Ordnungs­zahl 69 und besitzt wie andere Lantha­noide ein interes­santes Spektrum an meta­stabilen elek­tro­nischen Zuständen für Laser­anwen­dungen. Die Forscher nutzten Nano­kristalle mit drei­fach ioni­siertem Thulium und Ytter­bium.

Das Ytterbium regten die Forscher mit einem Laserstrahl von 980 Nano­metern Wellen­länge an. Dieses gab seine Anre­gungs­energie an das Thulium ab, wodurch sich dessen „Zustands­leiter” Schritt für Schritt bevöl­kerte und das Thulium Fluores­zenz­licht abstrahlte. Mit Hilfe eines zweiten Laser­strahls von 808 Nano­metern Wellen­länge ließ sich diese Fluore­szenz wieder unter­binden, denn diese Wellen­länge ent­spricht einem wich­tigen Über­gang im Thulium. Die durch diesen Laser indu­zierte Emis­sion entvöl­kerte den meta­stabilen Zustand wieder, so dass die die höheren Zustände im Thulium unbe­setzt blieben.

Die nun entwickelten Nanoteilchen besitzen Ausdehnungen von etwas über zehn bis zu vierzig Nano­metern, was unge­fähr der erreichten Auf­lösung von etwa dreißig Nano­metern ent­spricht. Wie sich zeigte, war die Konzen­tra­tion an Thulium-Ionen ent­schei­dend. Bei einer Dotie­rung von weniger als zwei Prozent in den Nano­teil­chen ließen sich auch mit vierzig Milli­watt starker 808-Nano­meter-Laser­strahlung höchstens fünfzig Prozent der Emis­sion unter­drücken. Bei Thulium-Dotie­rungen von mehr als vier Prozent hin­gegen erreichten die Forscher eine Absen­kung der Emis­sionen von über neunzig Prozent.

„Unsere Nanoteilchen haben den Vorteil, dass sie bei Wellenlängen funktio­nieren, die trans­parent für biolo­gisches Gewebe sind, und dass sie deshalb besonders nütz­lich für die Abbil­dung von tiefer im Gewebe liegenden Struk­turen sind, auch bei trüben Medien”, sagt Jin.

Anstelle von bisher genutzten Markern, die Abregungsintensitäten zwischen einem bis über 200 MW cm^-2 nutzen, benötigen die Thulium-dotierten Nano­kristalle nur 0,19 MW cm^-2, was sich mit einem nur einige Milli­watt starken Laser erreichen lässt.

Die neuartigen Nanopartikel besitzen zwar ihre Vorzüge, allerdings auch Nach­teile. So haben ihre leuch­tenden Zustände eine relativ hohe Lebens­dauer und damit einher­gehend ent­sprechend schwache Emis­sions­raten. Dies führt zu einem lang­sameren Ent­stehen der Pixel im Bild und damit zu einer größeren Auf­nahme­dauer – rund eine Größen­ordnung über der­jenigen von gewöhn­licher STED-Mikro­skopie.

Die Forscher wollen diese Probleme in den nächsten Monaten angehen. Eine Möglich­keit, höhere Auf­nahme­geschwin­dig­keiten zu erzielen, bestünde auch darin, parallel auf­zu­nehmen und Multi­plexing-Techniken zu verwenden. Auf­grund ihrer reich­haltigen Energie­niveaus, schmalen Emis­sions­linien und in Maßen durch­stimm­baren Lumines­zenz-Lebens­dauern sind diese Nano­teil­chen prinzi­piell gut für Multi­plexing geeignet.

„Wir wollen auch noch kleinere Nanopartikel erzeugen”, so Jin. Gut wären Kristall­größen unter zehn Nano­metern, besser noch unter fünf Nano­metern. Schon in wenigen Jahren wollen die Forscher dann mit ihrer Methode nicht nur tief in Gewebe­struk­turen blicken, sondern auch einzelne Moleküle in lebenden Zellen ver­folgen.

Dirk Eidemüller

RK