Lichtmikroskope werden noch präziser

Indem man die Fluoreszenz einzelner Farbstoffmoleküle nutzt, kann man die optische Auflösung von Lichtmikroskopen auf weniger 20 Nanometer bringen und damit die Beugungsgrenze um mehr als eine Größenordnung unterbieten. Ist ein fluoreszierendes Molekül jedoch nicht frei beweglich, so kann die starre Ausrichtung seines Übergangsdipolmoments die Positionsbestimmung um 50 bis 200 Nanometer verfälschen. Amerikanische Forscher haben jetzt ein optisches Verfahren entwickelt, mit dem man die Orientierung einzelner Moleküle ermitteln und dadurch ihre Position noch genauer bestimmen kann.

Superauflösende fluoreszenzmikrokopische Verfahren beruhen darauf, dass man im Untersuchungsobjekt, etwa einer biologischen Zelle, einzelne Farbstoffmoleküle zum Leuchten anregt. Das Licht eines fluoreszierenden Moleküls wird vom Mikroskop gesammelt und auf einen Detektor gelenkt, wo ein mehrere hundert Nanometer großer Lichtfleck als Bild des Moleküls entsteht. Das Zentrum eines isolierten Lichtflecks lässt sich auf ca. zehn Nanometer genau bestimmen. Damit sich nicht die Lichtflecke mehrerer Moleküle überlagern, lässt man immer nur wenige Moleküle gleichzeitig leuchten. Anhand der Molekülpositionen können dann submikroskopische Strukturen sichtbar gemacht werden.

Das setzt jedoch voraus, dass die Farbstoffmoleküle frei beweglich sind und ihr Übergangsdipolmoment keine festliegende Ausrichtung hat. Ist diese Voraussetzung nicht erfüllt, so weicht das Zentrum des Lichtflecks, den ein Molekül hervorruft, systematisch von der Position des Moleküls ab. Will man diesen Fehler korrigieren, so muss man die räumliche Orientierung der einzelnen Moleküle bestimmen – und zwar am besten mit Hilfe des Lichtmikroskops. Das ist jetzt William Moerner und seinen Kollegen gelungen.

Dabei griffen die Forscher auf ein von ihnen entwickeltes Verfahren zurück, das mit einem Lichtmodulator in der Optik des Mikroskops das von den Molekülen kommende Licht umwandelt. Dadurch ist das Bild eines einzelnen Moleküls nicht mehr ein kreisförmiger Lichtfleck, sondern es besteht aus zwei nebeneinander liegenden Lichtflecken. Aus der Orientierung der beiden Flecken hatten die Forscher in einem früheren Experiment die zur Bildebene (oder xy-Ebene) senkrechte z-Koordinate der Moleküle ermittelt.

Die Lichtflecken enthalten jedoch noch weitere Informationen. Aus dem Verhältnis der Helligkeiten der beiden Flecken lässt sich der Winkel θ ermitteln, unter dem der Vektor des Übergangsdipolmoments die Bildebene schneidet. Mit einem weiteren Winkel legt man die Orientierung dieses Vektors im Raume fest. Dieser Winkel , der die Ausrichtung des Vektors in der xy-Ebene beschreibt, lässt sich durch eine Messung des linearen Dichroismus des Moleküls bestimmen. Dazu bestrahlt man das Molekül mit linear polarisiertem Licht und misst in Abhängigkeit von der Polarisationsrichtung, wie viel Licht das Molekül reflektiert bzw. transmittiert. Das Verhältnis der beiden Lichtintensitäten legt den Winkel fest.

Auf diese Weise haben die Forscher für einzelne Moleküle des Farbstoffs DCDHF-N-6, die in einer Plexiglasschicht fixiert waren, die räumliche Orientierung des Übergangsdipolmoments bestimmt. Computerberechnungen zeigten, wie stark die gemessenen xy-Koordinaten eines ausgerichteten Moleküls von seiner tatsächlichen Position abwichen. Durch eine Korrektur der Molekülkoordinaten konnten Moerner und seine Kollegen die Genauigkeit der Abbildung erheblich verbessern und eine Auflösung von etwa 25 Nanometer erreichen. Sie sehen in ihrem Korrekturverfahren einen wichtigen Schritt auf dem Weg zu einer Lichtmikroskopie mit einer Auflösung von einem Nanometer, die gestatten würde, die molekularen Vorgänge in der lebenden Zelle sichtbar zu machen.

Rainer Scharf

PH