Neun auf einen Streich
Weiterentwickelte Fluoreszenzmikroskopie kann bis zu neun verschiedene Zellstrukturen gleichzeitig markieren und abbilden.
Mit der Fluoreszenzmikroskopie können Forscher Biomoleküle in Zellen sichtbar machen. Sie markieren die Moleküle mit fluoreszierenden Sonden, regen diese mit Licht an und nutzen die dadurch ausgelöste Fluoreszenz, um ein mikroskopisches Bild von den Strukturen der Zelle zu gewinnen. „Eine große Schwierigkeit dabei ist die eindeutige Unterscheidung der vielen fluoreszierenden Sonden, die sich teilweise sehr ähnlich sind“, sagt Thomas Niehörster, Doktorand an der Uni Würzburg. Um hier Fortschritte zu erzielen, haben die Wissenschaftler vom Biozentrum der Uni Würzburg eine neue Strategie entwickelt. Sie verwenden zur Anregung der Sonden jetzt drei abwechselnd gepulste Laser mit verschiedenen Wellenlängen. Zusätzlich nutzen sie Unterschiede im Emissionsspektrum der Sonden und das zeitlich leicht unterschiedliche Abklingen der Fluoreszenz aus, das sich im Bereich von wenigen Nanosekunden bewegt.
Abb.: Neun verschiedene Zellstrukturen wurden in einem Aufwasch fluoreszenzmarkiert und damit mikroskopisch unterscheidbar gemacht. (Bild: T. Niehörster, U. Würzburg)
Aus diesem Versuchsaufbau erhalten sie komplexe Daten, die sie mit einer selbst entwickelten Software analysieren. Das ganze Verfahren namens sFLIM – a spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy – funktioniert offenbar bestens: „Am Ende können wir die fluoreszierenden Sonden mit bisher unerreichter Genauigkeit voneinander unterscheiden“, sagt Gruppenleiter Markus Sauer. Auf diese Art lassen sich mit jedem der drei Laser jeweils fünf Fluoreszenzsonden unterscheiden, so dass theoretisch fünfzehn verschiedene Strukturen gleichzeitig darstellbar wären.
In der Praxis müssen sich die Forscher jedoch mit weniger zufriedengeben. „Es ist schwierig, so viele verschiedene Zellstrukturen gleichzeitig zu markieren, und es gibt dafür auch nur eine begrenzte Zahl von Sonden“, erklärt Niehörster. „Trotzdem ist es uns gelungen, neun Strukturen gleichzeitig zu markieren und abzubilden.“ Dazu gehören zum Beispiel das F-Actin-Proteingerüst des Zellskeletts, die Hülle des Zellkerns oder neu entstehende DNA. Durch die hohe Empfindlichkeit des Verfahrens können außerdem drei verschiedene Zellstrukturen gleichzeitig mit demselben Fluoreszenzfarbstoff markiert und am Ende trotzdem klar unterschieden werden. Das liegt daran, dass sich die Fluoreszenzeigenschaften je nach chemischer Umgebung in der Zelle geringfügig verändern und damit unterscheidbar werden.
JMU / RK
