02.05.2024

Optofluidische Antenne beobachtet fluoreszierende Moleküle

Effiziente Methode offenbart die Dynamik von einzelnen Biomolekülen.

Die Beobachtung der Dynamik von einzelnen Bio­molekülen ist für die Biowissen­schaften von höchstem Interesse, um Prozesse auf molekularer Ebene besser zu verstehen. Mit den derzeitigen Methoden basierend auf Fluoreszenz­messungen in wässriger Lösung ist die zeitliche Verfolgung von Verän­derungen innerhalb einer Molekülstruktur nicht schnell genug möglich. Physikern des Max-Planck-Instituts für die Physik des Lichts ist es gelungen, eine aus der Quantenoptik bekannte photonische Struktur – die planare optische Antenne – für die Nutzung in wässrigen Medien weiterzuentwickeln, um damit Prozesse, wie Konformations­änderungen einzelner Biomoleküle mit höchster zeitlicher Auflösung zu beobachten.

Abb.: Illustration einer Vier-Wege-DNA-Kreuzung, die mit zwei fluoreszierenden...
Abb.: Illustration einer Vier-Wege-DNA-Kreuzung, die mit zwei fluoreszierenden Molekülen markiert ist, und in einer optofluidischen Antenne diffundiert.
Quelle: D. Yovane

Dazu sammelt die opto­fluidische Antenne die von einzelnen fluores­zierenden Molekülen emittierten Photonen mit mehr als 85-prozentiger Effizienz auf. Die Forscher erreichen so eine Zeitauflösung im Mikrosekundenbereich. Das Gerät lässt sich einfach in viele bestehende Mikroskopieaufbauten integrieren und erweitert die methodische Palette im Labor. Die Untersuchung der komplizierten internen Dynamik von Biomolekülen auf Einzelmolekülebene in einer flüssigen Umgebung ist für die Lebenswissenschaften von großem Interesse. Fluoreszenz­messungen sind derzeit der Eckpfeiler in deren modernem Werkzeugkoffer, um schnelle und langsame dynamische Prozesse zu entschlüsseln. Hierbei werden spezielle Abschnitte der Biomoleküle mit fluoreszierenden Farbstoff­molekülen markiert, mit Laserlicht angeregt und Veränderungen ihrer Position zueinander durch das Messen der emittierten Photonen detektiert. Die Genauigkeit der Methode ist jedoch bei extrem schnellen Prozessen begrenzt, da nur eine limitierte Anzahl von Fluoreszenz­photonen pro Zeitintervall erfasst werden kann, bedingt durch die relativ niedrige Photonensammeleffizienz.

Nun zeigt das Team um Stephan Götzinger und Vahid Sandoghdar eine völlig neue hoch­effiziente Messmethode, die auf Strukturen beruht, die aus der Festkörper-Quantenoptik bekannt sind. Das Konzept der planaren optischen Antenne wurde von den Physikern bereits vor zehn Jahren entwickelt und konnte im Gegensatz zu herkömmlichen optischen Antennen ohne metallische Nano­strukturen realisiert werden. Durch eine geschickte Modifikation sind die neuen opto­fluidischen Antennen nun in der Lage auch Photonen, die von einem einzelnen Biomolekül in einer Lösung ausgesendet werden, mit sehr hoher Effizienz aufzusammeln. 

Die Antenne besteht aus einem Glassubstrat und einer einige hundert Nanometer dicken Wasserschicht, welche die zu untersuchenden Biomoleküle enthält. Die dünne Wasserschicht wird durch eine Mikro­pipette erzeugt, die nur wenige hundert Nanometer über dem Substrat positioniert ist. Durch die Ausübung eines definierten Drucks wird die Form des Wasser­meniskus in der Pipette gesteuert. Die axiale Begrenzung der Wasserschicht zwingt die Moleküle dazu, durch das Zentrum des Laserfokus zu diffundieren und erhöht so die Helligkeit. Das Fluoreszenz­signal der Moleküle wird durch die Antenna insgesamt etwa um das Fünffache erhöht. Gleichzeitig verlangsamt die Wasser-Luft-Grenzfläche die Diffusion der Moleküle, während die Antennengeometrie die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass ein Molekül zum Fokus zurückkehrt. 

Die Wissenschaftler demonstrieren die Leistungs­fähigkeit der optofluidischen Antenne gemeinsam mit der Arbeitsgruppe von Claus Seidel von der Universität Düsseldorf anhand der Untersuchung der Konformitäts­änderung einer spezifisch angeordneten DNA, – der Vierwege-DNA-Kreuzung. Zwei der Schenkel der Kreuzung sind mit einem Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Paar markiert, wobei sich die Anzahl der von jedem der beiden FRET-Partner emittierten Photonen mit dem Abstand der beiden Schenkel ändert. Die Forscher konnten mittels FRET-Trajek­torien belegen, dass ein vermuteter Konformations­zustand nicht auftritt bzw. geben eine obere Grenze für dessen Lebensdauer vor. Die neue Antenne ist in der Lage, die Dynamik der DNA-4-Wege-Kreuzung mit einer zeitlichen Auflösung von nur wenigen Mikrosekunden zu verfolgen.

„Unsere optofluidische Antenne funktioniert so gut, weil die Photonensammeleffizienz von langsamer diffundierenden Molekülen in dem räumlich begrenzten Kanal deutlich verbessert wird", so Stephan Götzinger. „Die Antenne ist ein leistungsfähiges Gerät für Untersuchungen in den Biowissenschaften. Sie ist nicht nur einfach zu bedienen, sondern lässt sich auch leicht in viele bestehende Mikroskopieaufbauten integrieren“, ergänzt Vahid Sandoghdar.

MPL / JOL

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