Höchstauflösende Lichtmikroskopie ohne Untergrund

Ein neues Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie haben Forscher am Karls­ruher Institut für Techno­logie ent­wickelt: Die STEDD-Nanoskopie – STEDD steht für „Stimu­lated Emission Double Deple­tion“ – liefert nicht nur höchst­aufge­löste Bilder, sondern unter­drückt auch den Unter­grund. Daraus ergibt sich eine deut­lich bessere Bild­qualität, von der beson­ders die Analyse drei­dimen­sional dicht ange­ord­neter sub­zellu­lärer Struk­turen profi­tiert.

Konventionelle Lichtmikroskopie hat eine auf die halbe Wellen­länge des Lichts – etwa zwei­hundert Nano­meter – begrenzte Auf­lösung, sodass feinste zellu­läre Struk­turen im Bild ver­schwimmen. In den vergan­genen Jahren wurden verschie­dene Ver­fahren der Nano­skopie ent­wickelt, welche die Beugungs­grenze über­winden und höchst­aufge­löste Bilder liefern. Jetzt haben die KIT-Forscher die „Stimu­lated Emission Deple­tion“-Nano­skopie so erwei­tert, dass sich der in den Bildern stets vorhan­dene Unter­grund durch eine modifi­zierte Bild­auf­nahme effi­zient unter­drücken lässt. Die Bild­quali­tät ist dadurch deut­lich besser, was vor allem für die quanti­tative Daten­analyse von drei­dimen­sional dicht ange­ord­neten Mole­külen und Zell­struk­turen von großem Vor­teil ist.

Bei der Fluoreszenzmikroskopie wird die zu untersuchende Probe mit einem stark fokus­sierten Licht­strahl abge­rastert, um Farb­stoff­mole­küle zur Aussen­dung von Fluores­zenz­licht anzu­regen. Die Licht­quanten werden Pixel für Pixel regis­triert und so das Bild aufge­baut. Bei der STED-Nano­skopie wird der zum Abrastern verwen­dete Anre­gungs­strahl von einem weiteren Strahl über­lappt, dem STED-Strahl. Dessen Licht­inten­sität liegt ring­förmig um den Anre­gungs­strahl herum, im Zentrum ist sie null. Außer­dem ist der STED-Strahl zu grö­ßeren Wellen­längen hin ver­schoben. Der STED-Strahl nutzt die stimu­lierte Emis­sion, um die Fluores­zenz­anre­gung über­all abzu­schalten – außer im Zentrum, wo der STED-Strahl keine Inten­sität besitzt. Dadurch wird die Anregung einge­schnürt und es ent­steht ein schär­ferer Licht­fleck für die Raste­rung. Aller­dings gibt es in dem hoch­aufge­lösten STED-Bild stets einen niedrig aufge­lösten Unter­grund, der zum einen durch unvoll­stän­diges Ab­schalten, zum anderen durch Fluores­zenz­anre­gung durch den STED-Strahl selbst verur­sacht wird.

Die Forschergruppe um Gerd Ulrich Nienhaus hat die STED-Methode um einen zweiten STED-Strahl erweitert. Dieser STED2-Strahl folgt dem STED-Strahl zeit­ver­zögert und löscht das im Zentrum vorhan­dene Nutz­signal aus, sodass nur noch die Unter­grund­anre­gung übrig bleibt. „Beim STEDD-Ver­fahren werden zwei Bilder aufge­nommen“, erklärt Nien­haus. „Zum ersten und zum zweiten Bild tragen jeweils Photonen bei, die vor bezie­hungs­weise nach dem Ein­treffen des STED2-Strahls regis­triert werden.“ Durch gewich­tete Diffe­renz­bil­dung wird das zweite Bild, das nur Unter­grund ent­hält, vom ersten Bild, das Nutz­signal plus Unter­grund enthält, Pixel für Pixel abge­zogen. Ergeb­nis ist ein höchst­aufge­löstes, unter­grund­freies Bild.

KIT / RK